对生物实验试剂－－-层析液配方改进的探索与思考

对生物实验试剂---层析液配方改进的探索与思考

傅萍萍 （浙江省萧山中学  邮编：311201  电话83711701 手机 13306509339）

摘  要   关注人的发展是新课程的核心理念，这一理念要求生物实验员在实验室管理与教学中，既要掌握生物实验的基本操作技能，提高学生的实验能力，发展学生的智力，更要关心学生的身体健康，避免实验药品的危害。苯是一种毒性很强的有机物，美国早在1992年就停止苯在学生实验中的使用。在《光合色素的提取和分离》实验中，笔者根据学校现有的条件，经过课余多次实验试验，发现用低毒性的甲苯代替苯对层析液的配方进行改进，不但可以减轻药品苯对师生身体的危害，还可以使四条色素带分离更明显。因此，笔者建议用甲苯替代苯配制层析液，使实验更安全、环保，使实验效果更好。

关键词   苯  甲苯  层析液  色素分离 

 一、课题的提出

 生物学是一门以实验和观察为主的学科。生物实验教学在激发学生的学习兴趣、培养学习动机、巩固知识、开发智力和创新思维、形成实事求是的科学态度以及协作精神等方面起着重要的作用，是实施素质教育的最有效形式。生物课程标准明确提出：生物教学要加强实验和其他实践活动的教学，加强对学生观察能力、实验能力、思维能力和自学能力等能力的培养；要关注教学资源的开发，如利用替代物品、药剂、仪器等，争取创造性地增加低成本的实验和其他实践活动，消除生物实验的安全隐患，促进学生的健康成长与发展。作为一名已有20多年实验工作经验的实验员，深知学生才是教学过程的起点和终点，是教育的本体，关注人的发展是新课程的核心理念；深知自己唯有高度重视实验教学，积极投身于新课程改革的大环境中，坚持以“管理育人，服务育人”的理念，时刻为学生的终身发展服务，为提高学生的生物科学素养着想，才能应对现代社会和教育发展对实验教师的需要。

    然而生物实验中有不少药品具有一定的刺激性、腐蚀性和毒性，如氢氧化钠溶液呈强碱性，对人体健康具有负面影响，使用时务必小心，最好能戴上手套；过氧化氢具有强腐蚀性，对身体有害，经人体皮肤吸收可造成伤害，最好戴好手套和护目镜；丙酮、二苯胺具有一定的毒性，使用后务必洗手，等等。从学生的健康着想，笔者以为在生物实验中一方面要培养学生的卫生与健康意识，培养学生良好的生活卫生习惯，另一方面教师更应探索用低毒性或无毒性的药品代替毒性较强的药品，以减轻药品对学生身体的危害，使实验更安全、环保，这也是每一位教师义不容辞的职责与任务。

    高中生物《光合色素的提取和分离》实验中，由于层析液的成份苯对师生的健康危害较大，因此从学生、老师的身体安全考虑，多年来笔者一直在苦苦探索一种无毒性或低毒性的药品来替换它。经过课余时间多次的实验试验，笔者发现用低毒性的甲苯代替苯对层析液的配方进行改进，不但可以减轻药品苯对师生身体的危害，还可以使四条色素带分离更明显。为此笔者提出了用低毒性的甲苯代替苯对层析液配方进行改进的建议。下面就此问题谈谈自己的实践探索与思考，以供同行参考。

     二、课题研究的理论依据

1. 苯在“光合色素的提取和分离”中的作用

光合色素在光合作用中起着吸收、传递与转化光能的作用，为了能让学生更深地理解叶绿体中色素的作用，叶绿体中色素的种类与颜色，高中生物新课程仍安排了“光合色素的提取和分离”实验。其实早在 1954年，生物化学家阿诺恩从菠菜叶细胞中获得十分完整而且能够把全部光合反应进行到底的叶绿素。绝大多数植物叶绿体中含有胡萝卜素、叶黄素、叶绿素a和叶绿素b。其中叶绿素a存在于所有放氧生物中，叶绿素b存在于高等植物和绿藻中。

在高中生物实验中，《光合色素的提取和分离》实验一直占有很重要的地位。实验要求将绿叶中的各种色素提取出来，并用纸层析法把各种色素在滤条上分离开，形成一条条不同色素相对应的色带。实验的基本原理是：

（1）绿叶中的色素能够溶解在有机溶剂丙酮、乙醇中，因此，可以用丙酮、乙醇来提取绿叶中的色素。

    （2）绿叶中的色素都能溶解在层析液中，不同的色素在层析液中的溶解度不同，溶解度高的色素随层析液在滤纸上扩散得快，反之则慢。所以，几分钟之后，绿叶中的色素就会随着层析液在滤纸上的扩散而分离开。由于苯是一种良好的有机溶剂，而且性质相对比较稳定。因此，苯一直以来被作为该实验的层析液材料。这种层析液的配置方法为：20份石油醚、2份丙酮、1份苯。

2.用甲苯代替苯对层析液配方进行改进的依据

众所周知，苯是一种毒性大、渗透性较强、易挥发的有机物。它可以通过皮肤、呼吸道进入人体，而且难以排泄。短时间内吸入高浓度苯蒸气可造成急性中毒，产生头痛、头晕、咳嗽、胸闷、兴奋、步态蹒跚、神志模糊、血压下降、肌肉震颤、呼吸浅快、脉搏快而弱等现象。

早在1982年，医学家首次发表了苯与白血病有关的研究报告。此后，许多国家相继报道了由于接触苯而发生再障淋巴瘤和白血病等造血系统的病例。无论是流行病学调查还是实验室研究，都证明大量接触苯与白血病有因果关系。世界卫生组织下属国际癌症研究机构（IARC）1993年对苯的致癌性评级为：一类人类致癌物。其主要有以下四个方面：

1、直接致癌机制；

2、破坏骨髓微循环，导致造血干细胞分化和成熟迟缓，乃至凋亡；

3、产生大量自由基并形成损伤；

4、动物实验表明，苯代谢可与细胞中的DNA结合，在组织中形成DNA化合物，并抑制DNA和RNA合成。

2007年10月，有机化学博士、现任美国3M公司产品部门代表张亦帆先生来母校参观实验室时，也严肃地指出：苯是一种毒性很强的有机物，美国早在1992年就禁止在学生实验中使用苯。再说目前一般农村高中生物实验室的通风设备还比较差，除了开门窗通风换气以外，几乎没有其他通风设备。尽管在层析液中苯的含量较少，但几十个组合在一起，加上学生在操作中不小心打翻，清洗时残液的挥发，整个实验室还是充满了苯蒸气。苯主要是以蒸气形态经呼吸道进入人体，这给学生、老师的身体健康带来很大的危害。07学年实施的《普通高中生物课程标准（生物）》对该实验的安全性也有所提高，已将溶解色素用的丙酮改为乙醇，但层析分离时所用的层析液仍采用毒性很强的苯进行配制。

本人在二十多年的生物实验工作经历中也发现，该层析液对学生和老师的健康危害较大，经常会有头疼、恶心现象发生，其首当其冲的就是苯。而甲苯属低毒，进入人体后，可以在人体的NADP（转酶Ⅱ）存在下被氧化成苯甲醇，再在NAD（转酶Ⅰ）存在下氧化为苯甲醛，生成甲基苯甲酸，然后与甘氨酸结合形成甲基马尿酸，在18小时内几乎全部排出体外。即使是吸入后残留在肺部的少量的甲苯，也在接触后3小时内（半衰期为0.5—1小时）全部呼出体外。实验中残留的甲苯，在清洗时进入水体，由于甲苯在水溶液中挥发的较快，其在地表水中，不是持久性的污染物，挥发到空气中的甲苯也能被光解。因此，无论是安全方面，还是环保方面，该实验中使用甲苯都比使用苯更加合适。为学生、老师的身体健康考虑，根据学校现有的条件，笔者通过多次实验探索，发现用低毒的甲苯取代苯来完成“光合色素的提取和分离”实验能够得到更好的效果。

三、用甲苯代替苯对层析液配方进行改进的探索

1.实验步骤

笔者在每次试验中，为确保实验结果的可行可信，都统一采用了新鲜的菠菜叶作为提取色素的材料，用95％乙醇作溶解色素的溶剂，将20份石油醚（60—90℃下分馏）、2份丙酮、1份甲苯配制成层析液；每次试验都采用对比实验；每次对比实验都采用同一磨制、过滤的色素溶解液与同时用苯和甲苯配制的不同的层析液进行实验，得到了非常理想的实验效果。具体操作过程如下：

⑴ 将剪成一厘米宽十厘米长的滤纸条放干燥箱进行干燥处理。

⑵ 分别用一份苯和甲苯与二份丙酮、二十份石油醚配制成两种不同的层析液。

⑶ 在研钵中放入5克剪碎的新鲜的菠菜叶子、0.5克碳酸钙、0.5克二氧化硅，先将其快速研磨成浆状，再放入12毫升95％乙醇快速研磨使其混合均匀，静置十几秒钟。

⑷ 过滤提取上述⑶中的滤液。

⑸ 点样。用自制的毛细吸管在干燥处理过的滤纸条上画滤液细线。（为确保有足够的色素，形成清晰的色素带，有利于分析，在试验中每次待滤液干燥后再重复画3次到5次直到8次。）

⑹ 分离叶绿体中的色素。将点样后的滤纸条一分为二，分别同时放入盛有不同的层析液的小烧杯中进行层析。

⑺ 观察小烧杯中滤纸条上色素分离的情况，并记录所需时间。

⑻ 分析实验结果。

为保证实验结果的正确性，每次试验都采用足够量的滤纸条，并且在不同的时间段反复进行。同时对用甲苯配制而成的层析液的稳定性进行试验，通过对其进行连续七天的跟踪实验，得知只要将该层析液保存在密闭容器里，一个星期内其效果将始终保持不变。

下表是生物实验教师与高一两个班级学生进行对比实验的结果记录：

层析液

20份石油醚 2份丙酮

    1份甲苯

  20份石油醚 2份丙酮

      1份苯 

实验材料

新鲜不沾水菠菜叶子5克

碳酸钙0.5克

二氧化硅0.5克

无水乙醇12毫升

新鲜不沾水菠菜叶子5克

碳酸钙0.5克

二氧化硅0.5克

无水乙醇12毫升

画滤液细线次数

8次

8次

层析时间

5分

5分

实

验

结

果

出现四条色素带所占比例

老师多次实验

100％

0

学 生实 验

91.5％

23％

只出现三条色素带所占比例

（无胡萝卜素）

老师多次实验

0

100％

学 生实 验

8.5％

77％

在学生的对比实验中，由于少数学生在层析时心太急，过早的从层析液中取出滤纸条，因此导致只出现了三条色素带的情况。

2. 实验结果分析

从以上实验结果中我们可以清楚地看到：

1、用甲苯代替苯，没有影响扩散效果。两种情况下，扩散的速度基本一致。3分钟时，用甲苯作层析液材料的滤纸条上，已清楚显示出四条色素带，5分钟后逐步达到稳定。

2、用甲苯代替苯，实验能够获得更明显的四条色素带。特别是第一条胡萝卜素与第二条叶黄素之间，分离十分明显。【见图一】

叶黄素

叶绿素b

胡萝卜素

 叶绿素a

层析液高度

                                  图一

（图中右边三条层析时间为5分钟，左边三条层析时间为7分钟。）

这是笔者在层析液配方改进试验中得到的又一大收获。笔者从事生物实验工作二十余年，在辅导学生做该实验时从未发现过这么漂亮齐全的四条色素带。一直以来，我们都采用苯配制层析液，通常只能比较清楚地看到叶黄素、叶绿素a、叶绿素b三条色素带和一条扩散的特别高（与层析液上升的高度平齐）、特别细、特别齐的橙黄色带，往往被部分生物教师与学生错误地认为这是胡萝卜素，其实这仅是一条层析高度的痕迹而已，并不是真正的胡萝卜素，希望教师们引起注意。【见图二】

叶绿素b

叶黄素

层析液高度

叶绿素a

                                    图二

 （图中右边三条层析时间为5分钟，左边三条层析时间为7分钟。）

由此可见，长期以来本实验中其实根本没有层析出真正的胡萝卜素色素带，难怪最上面的那条带子由于其颜色、位置（特别是颜色）与胡萝卜素色素带非常相近，好多师生就以为这就是胡萝卜素的色素带了，因而始终认为实验的成功率很高。但笔者始终早就觉得不对劲：为什么这条色素带与下面三条色素带的形状完全不同？而且无论实验成功与否，哪怕其它三条色素带都没有层析出来，它始终是哪么整齐的存在在滤纸条上。为排除绿叶的问题，笔者采用不同的绿叶来提取色素滤液进行反复层析试验，通过仔细观察发现这条其实并非胡萝卜素，而是层析液上升的高度所留下的痕迹。那为什么没有胡萝卜素色素带？实验之余也常与任课老师探讨此问题，但总是以胡萝卜素是很难做出来的，胡萝卜素与叶黄素是很难拉开的结果而告终。在这次试验中终于让我、让老师们清楚地看到这条实实在在的橙黄色的胡萝卜素，清楚地看到这完整的四条色素带。同时也彻底消除了过去的误解。

2008年11月11日——11月14日，在我校高二年级《光合色素的提取和分离》学生实验中，全面采用用甲苯配制的层析液来做此实验，取得很好的实验效果。除了少数同学由于受时间的限制或操作不够熟练而导致实验没有成功外，基本上都获得了四条清晰的色素带。我们随机统计了一个班，成功率达83％。

四、对用甲苯代替苯对层析液配方进行改进的实验结论与思考

1．实验改进建议

由上实验可知，甲苯与苯对色素的溶解度虽然有所不同，稳定性也有所不同，但是用甲苯替代苯进行实验，对四条色素带扩散的时间没有什么影响，而且四条色素带的扩散效果更好，实验也更加安全、环保。因此，笔者认为在高中生物“光合色素的提取和分离”实验中可用甲苯替代苯配制层析液，这将有利于学生对实验现象的观察，有利于师生的身体健康。

2．实验探索思考

本课题的实验探索对笔者的触动很大，从中笔者认识到开展生物实验研究，改进实验器材与药品，让学生和老师在更加安全、更加环保的环境内探究科学知识，切实值得生物实验员去探索与实践。因为生物学不仅是一个知识体系，更是一个探究的过程，实验探究是生物科学的基本特征之一，是促进学生学习与理解生物科学的必要条件。生物教师理应在生物教学中体现探究教学的特性，让学生在探究中经历获取知识的过程，在主动学习中领悟科学研究的思维方法，培养科学的态度，发展知识与能力，提升生物学素养。作为生物实验员，也必须重视生物实验教学，积极开展生物实验的改进（包括生物实验材料、实验试剂、药品用量等）研究，为全面贯彻《标准》的基本要求，提高公民的生物科学素养，造就一支强有力的生物科技大军添砖加瓦。在此，我建议同行们行动起来，摒弃过于注重知识讲授的教学观，加强实验教学研究。

3．后续研究展望

还需要说明的是，在以往的学生实验中，用苯、石油醚、丙酮配制的层析液基本上不能层析出四条色素带，绝大多数是三条色素带。在07年11月至12月上旬教师的多次对比实验中，用苯、石油醚、丙酮配制的层析液也层析不出四条色素带。然而在08年1月9日的学生对比实验中,在用苯、石油醚、丙酮配制的层析液中却层析出了少量的比较明显的四条色素带。在统计、分析实验结果时还发现：若用苯配制的层析液中能层析出四条色素带，则用甲苯配制的层析液中一定能层析出四条色素带，而当用甲苯配制的层析液中能层析出四条色素带时，用苯配制的层析液却不一定能层析出四条色素带。这是操作中的问题，还是气候（温度、湿度）的问题，还有待于进一步的研究。另外，本课题用甲苯配制层析液的实验试剂改进只是一种思路，仅起抛砖引玉的作用，望同行经过探索后，能用更好的药品来代替苯，让学生和教师在更安全、更环保的前提下来完成这一实验。

附：在同一时间、用同一磨制而成的色素滤液点样，分别在用苯和甲苯配制的层析液中层析5分钟分离而成的实验结果对照照片一张。

在苯配制的层析液中层析而成      在甲苯配制的层析液中层析而成

主要参考资料

朱正威、赵占良.2004.普通高中生物课程标准（实验）.北京：人民教育出版社，97-98

赵占良.2003.全日制普通高级中学教科书（必修）生物.北京：人民教育出版社，53-54

吴相钰、刘恩山.2008.普通高中课程标准实验教科书.生物学（必修1）.浙江科学技术出版社